Βλέποντάς το να αναπτύσσεται: δημιουργώντας ένα ψηφιακό έμβρυο

Μετάφραση από Αναστασία Πεχτελίδου, Εκπαιδευτικός Β/θμιας Εκπαίδευσης, Βιολόγος-ΜΔΕ

Η εικόνα προσφέρθηκε από EMBL Photolab

Τι θα λέγατε εάν μπορούσατε να γίνετε μάρτυρες της ανάπτυξης μιας νέας ζωής, να μελετήσετε με την ησυχία σας κάθε λεπτομέρεια, κάθε κύτταρο, από κάθε σκοπιά και οποιαδήποτε χρονική στιγμή; Η Sonia Furtadoμιλάει με τους επιστήμονες που έκαναν την παραπάνω υπόθεση πραγματικότητα, δημιουργώντας ένα ψηφιακό έμβρυο του zebra fish (Brachydanio rerio).

Φανταστείτε ότι το Google Earth™ παίρνει νέες φωτογραφίες από δορυφόρο σε τακτά χρονικά διαστήματα, έτσι ώστε να μπορείς- όχι μόνο να παρατηρήσεις ολόκληρο τον πλανήτη και να μεγεθύνεις πάνω σε διάφορες χώρες ή πόλεις- αλλά και να γυρίσεις πίσω στη σειρά των φωτογραφιών και να δεις τι άλλαξε τα τελευταία 10 ή 20 χρόνια. Αντικαταστήστε τώρα τη Γη με ένα αναπτυσσόμενο έμβρυο zebra fish, συγκεντρώστε μερικές εκατοντάδες χιλιάδες στιγμιότυπα σε διάστημα 24 ωρών, και θα έχετε αυτό που οι επιστήμονες στο Ευρωπαϊκό Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας (EMBL)^w1 αποκαλούν «ψηφιακό έμβρυο».

Ο βιοφυσικός Philipp Keller, οι βιολόγοι Annette Schmidt και Jochen Wittbrodt και ο φυσικός Ernst Stelzer συνεργάστηκαν για να αναπτύξουν μια τεχνική απόκτησης μιας τρισδιάστατης απεικόνισης των πρώτων 24 ωρών ανάπτυξης ενός εμβρύου του zebra fish (Keller et al., 2008). Όλα ξεκίνησαν στην αρχή του 2006, οπότε ένας υπότροφος πρότεινε στον Philipp να τοποθετήσει απλά ένα έμβρυο στο μικροσκόπιο και να εντοπίσει όλα τα κύτταρα. Με αφορμή αυτή τη συζήτηση, ο Philipp έριξε ξανά μια ματιά στη μικροσκοπία φωταύγειας σε μονό επίπεδο(single-plane illumination microscopy- SPIM) (βλ.γλωσσάρι για όλους τους όρους με πλάγια γράμματα), μια τρισδιάστατη τεχνική απεικόνισης που είχε αναπτυχθεί προηγούμενα από την ομάδα του Ernst. Προσάρμοσε τις βασικές αρχές της SPIM στην παρακολούθηση της εμβρυϊκής ανάπτυξης. Ως αποτέλεσμα δημιουργήθηκε η μικροσκοπία φθορισμού ψηφιακής σάρωσης με ακτίνες λέιζερ (digital scanned laser light sheet fluorescent microscopy- DSLM).

Οι Ernst Stelzer, Philipp Keller, Jochen Wittbrodt και η Annette Schmidt Η εικόνα προσφέρθηκε από EMBL Photolab

Επειδή τα κύτταρα σε ένα αναπτυσσόμενο έμβρυο διαιρούνται και κινούνται συνεχώς, τα στιγμιότυπα πρέπει να λαμβάνονται σε πολύ μικρά διαστήματα ώστε να εντοπίζονται οι αλλαγές. Αυτό απαιτεί ένα μικροσκόπιο που συνδυάζει την υψηλή ταχύτητα απεικόνισης με την υψηλή ποιότητα εικόνας, ώστε να διακρίνει κανείς κύτταρα σε πολύ κοντινή απόσταση μεταξύ τους. Προκειμένου, φυσικά, να παρακολουθήσει κανείς την εμβρυϊκή ανάπτυξη, πρέπει τα κύτταρα να διατηρηθούν ζωντανά και υγιή σε μια περίοδο μιας ή δύο ημερών, και το μικροσκόπιο να μη βλάψει τη φθορίζουσα χρωστική που χρησιμοποιείται για το μαρκάρισμα των κυττάρων.

Σχηματική απεικόνιση ενός μικροσκοπίου φθορισμού ψηφιακής σάρωσης με ακτίνες λέιζερ (DSLM): η ακτίνα λέιζερ (με μπλε χρώμα) ακτινοβολεί το δείγμα από το πλάι και σαρώνει γοργά ένα δισδιάστατο επίπεδο. Το φως από φθορισμό (με γαλάζιο χρώμα) που εκπέμπεται από το δείγμα φιλτράρεται στη συνέχεια, ώστε να επιλεγεί μονάχα το σήμα στο επιθυμητό μήκος κύματος (πράσινο), και ανιχνεύεται με μια κάμερα τοποθετημένη στις σωστές γωνίες ως προς το ακτινοβολούμενο επίπεδο, ώστε να παραχθούν οι εικόνες. Κάντε κλικ στην εικόνα για μεγέθυνση Η εικόνα προσφέρθηκε από Petra Riedinger

Η λύση που δόθηκε ήταν να χρησιμοποιηθεί μια πολύ λεπτή ακτίνα λέιζερ, ώστε να ελαχιστοποιηθεί η ζημιά τόσο στη χρώση όσο και στο έμβρυο. Αυτή η ακτίνα διαπερνάει το έμβρυο κατά την παρατήρηση, διεγείροντας τη φθορίζουσα χρωστική στα κύτταρα και προκαλώντας την εκπομπή φωτός. Η ακτίνα λέιζερ κινείται σε κάθετο άξονα και το φως που εκπέμπεται από το δείγμα λόγω φθορισμού, σε γωνία 90° ως προς την ακτίνα, ανιχνεύεται από μια κάμερα, παράγοντας μια εικόνα τομής πάχους μόλις κάποια χιλιοστά του χιλιοστομέτρου (βλέπε βίντεο 1w2). Έπειτα, το έμβρυο μετακινείται οριζοντίως κατά ένα πολύ μικρό βήμα, και σαρώνεται η επόμενη τομή. Μόλις έχει γίνει σάρωση ολόκληρου του εμβρύου από μια οπτική γωνία, αυτό περιστρέφεται κατά 180° και σαρώνεται ξανά, ώστε αργότερα να συντεθεί μια πλήρης τρισδιάστατη εικόνα. Καθ’ όλη τη διάρκεια της διαδικασίας το έμβρυο παραμένει ζωντανό και συνεχίζει να αναπτύσσεται, οπότε οι τομές μπορούν να επαναληφθούν περιοδικά στο ίδιο έμβρυο και να συγκριθούν, ώστε να εντοπιστούν οι αλλαγές. Οι επιστήμονες του EMBL «τεμάχισαν» τα έμβρυα του ψαριού-ζέμπρα κάθε 60 ή 90 δευτερόλεπτα σε ένα διάστημα 24 ωρών, λαμβάνοντας περίπου 400000 εικόνες ανά έμβρυο.

Η επόμενη πρόκληση ήταν να επινοηθεί ένας τρόπος για να αναλυθούν όλα τα δεδομένα όγκου τριών Tbytes για κάθε έμβρυο. Οι επιστήμονες διάλεξαν μια αυτοματοποιημένη προσέγγιση: χρησιμοποίησαν ταυτόχρονα παράλληλη συστοιχία ηλεκτρονικών υπολογιστών, τόσο στο EMBL της Χαϊδελβέργης όσο και στο Ινστιτούτο Τεχνολογίας της Καρλσρούης (Karlsruhe Institute of Technology) στη Γερμανία^w3. «Σε κάθε υπολογιστή δίνεται ένα στιγμιότυπο του εμβρύου, ώστε να αναζητήσει σε αυτήν την εικόνα τους κυτταρικούς πυρήνες», εξηγεί ο Philipp. Κάθε πυρήνας εκπροσωπεί ένα κύτταρο, άρα με συνδυασμό των πληροφοριών για όλες τις τομές, οι επιστήμονες μπορούν να παράγουν το ψηφιακό έμβρυο: μια οπτική αναπαράσταση όλων των εμβρυϊκών κυττάρων, όπου φαίνεται το πού βρίσκονται την κάθε στιγμή, πού μετακινούνται την επόμενη και το πότε και πού διαιρούνται. Το αποτέλεσμα είναι ένα τρισδιάστατο βίντεο του αναπτυσσόμενου εμβρύου με χρονοδιαλείμματα.

Καταγραφή DSLM της εμβρυογένεσης του zebra fish από τις πρώιμες κυτταρικές διαιρέσεις μέχρι τη γαστριδίωση
Η εικόνα προσφέρθηκε από EMBL Photolab

Αυτό επέτρεψε στον Philipp, την Annette και τον Jochen να ρίξουν φως στα διαφορετικά στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης του zebra fish. Σε πολύ πρώιμο στάδιο το έμβρυο του οργανισμού αυτού είναι μια ομάδα κυττάρων που «κάθονται» στην κορυφή του λεκιθικού ασκού (την πηγή θρεπτικών του εμβρύου). Στην αρχή τα κύτταρα διαιρούνται σαν ένα κύμα που κινείται από το κέντρο προς όλες τις κατευθύνσεις, όπως ένα κυματισμός στο νερό. Η ανασύσταση έδειξε ότι- μετά τις πρώτες εννέα κυτταρικές διαιρέσεις- το πρότυπο της διαίρεσης μετατρέπεται σε ένα κύμα που κινείται από το κέντρο προς μία μόνο κατεύθυνση, και έπειτα διαχωρίζεται και συνεχίζει γύρω από την περιφέρεια σε δύο ημικύκλια (βλ. παρακάτω εικόνα και το βίντεο 10^w2). Η γραμμή μεταξύ των δύο αυτών ημικυκλίων θα αποτελέσει αργότερα το σωματικό άξονα του ζώου, καθορίζοντας τη συμμετρία του σώματος. Έτσι, οι επιστήμονες ανακάλυψαν πως ο άξονας συμμετρίας στο zebra fish καθορίζεται σε πιο πρώιμο στάδιο κατά την ανάπτυξή του από ό,τι είχε αρχικά υποτεθεί, σε μια περίοδο όπου τα μητρικά γονίδια (στη μορφή αποθεματικών mRNA στο αβγό) χρησιμοποιούνται απλά ακόμη για την παραγωγή πρωτεϊνών.

Το πρότυπο κυτταρικής διαίρεσης υφίσταται μια διακοπή συμμετρίας κατά την πρώιμη εμβρυογένεση του ψαριού-ζέμπρα: από γρήγορα ακτινικά κύματα (κύκλοι 1 έως 9) σε αργά κυκλοτερή περιφερειακά κύματα (κύκλοι 10 έως 13)
Η εικόνα προσφέρθηκε από Nicola Graf

Οι ερευνητές επίσης μελέτησαν τη γαστριδίωση, τη διαδικασία κατά την οποία τα κύτταρα από την αρχική μονή εξωτερική στιβάδα του εμβρύου μεταναστεύουν στο εσωτερικό, ώστε να σχηματίσουν τις υπόλοιπες δύο βλαστικές στιβάδες, και όλες μαζί να δώσουν τελικά τους διαφορετικούς τύπους ιστών. «Χρειάζονται αρκετές σελίδες σε ένα βιβλίο για να περιγράψεις αυτήν τη διαδικασία, αλλά όταν βλέπεις τις εικόνες από το ψηφιακό έμβρυο, ξαφνικά είναι τόσο ευκολότερο να καταλάβεις,» λέει η Annette. Επιπλέον, αυτή και οι συνεργάτες της ανακάλυψαν ότι τα βιβλία στην πραγματικότητα κάνουν λάθος.

Υπήρχε μια διαρκής, κάποιες φορές ένθερμη, αντιπαράθεση στον τομέα αυτό από τη δεκαετία του 1980, σχετικά με το πώς τα κύτταρα μεταναστεύουν για να δημιουργήσουν αυτές τις στιβάδες. Η επικρατούσα βιβλιογραφική άποψη ήταν ότι τα κύτταρα υποστρέφονται- δηλαδή, μεταναστεύουν σε ένα άνοιγμα του εμβρύου και κυλούν ώστε να σχηματίσουν ένα στρώμα στην κάτω πλευρά, σαν ένα σκουφάκι κολύμβησης που καλύπτει το κεφάλι μας εσωτερικά. Ωστόσο, μερικοί επιστήμονες υποστήριζαν ότι μεμονωμένα κύτταρα της εξωτερικής στιβάδας απλά καταδύονται ή εισέρχονται, ακριβώς από το σημείο όπου βρίσκονται, ώστε να σχηματίσουν ένα στρώμα από κάτω.

Οι τρεις βλαστικές στιβάδες ενός εμβρύου σχηματίζονται κατά τη γαστριδίωση. Στο έμβρυο του zebra fish, αυτό μπορεί να γίνει μέσω υποστροφής ή εισχώρησης των κυττάρων
Η εικόνα προσφέρθηκε από Nicola Graf

«Πραγματικά επιλύσαμε το θέμα πολύ όμορφα,» λέει ο Jochen. «Τελικά όλοι είχαν δίκιο!» Εξαρτάται από το πού ψάχνει κανείς. Στη μια πλευρά του εμβρύου τα κύτταρα υποστρέφονται, ενώ στην άλλη πλευρά εισέρχονται (βλ. βίντεο 16^w2). Η διαφωνία είχε ξεκινήσει επειδή διαφορετικοί επιστήμονες έψαχναν σε διαφορετικά τμήματα του εμβρύου. Εφόσον δε μπορούσαν να ξετυλίξουν την όλη διαδικασία, ήταν αδύνατο να επισημάνουν ακριβώς ποιο τμήμα μελετούσαν. Ξεπερνώντας αυτά τα εμπόδια, οι επιστήμονες του EMBL μπόρεσαν να αποκαλύψουν την αλήθεια.
Οι ερευνητές χρησιμοποίησαν επίσης το ψηφιακό έμβρυο ως ένα αναπτυξιακό αποτύπωμα, ώστε να ανακαλύψουν από πού προέρχονται τα κύτταρα που συνιστούν ένα συγκεκριμένο όργανο ή ιστό. Σαν ένα πρώτο παράδειγμα χρησιμοποίησαν το μάτι. Στην ψηφιακή αναπαράσταση, σε προχωρημένο αναπτυξιακό στάδιο (πχ. προς το τέλος του 24-ωρου βίντεο), οι επιστήμονες σήμαναν τα κύτταρα που ήξεραν ότι εμπλέκονται στο σχηματισμό του ενός ματιού του ψαριού-ζέμπρα. Έπειτα παρακολούθησαν τα κύτταρα σε πρωθύστερο χρόνο, ώστε να βρουν από πού προέρχονται (βλ. βίντεο 11^w2).

Οι επιστήμονες κοινοποίησαν τα ψηφιακά τους βίντεο στο διαδίκτυο^w2, μαζί με εργαλεία ανάλυσης δεδομένων μικροσκοπίας για άλλους επιστήμονες. Και μετά τι; Με το Google Earth, εκτός από το ότι βλέπουν ολόκληρο τον πλανήτη και μεγεθύνουν σε διάφορα μέρη, οι χρήστες μπορούν να προσθέσουν τα δικά τους σχόλια και επισημάνσεις και να δουν αυτά που προστέθηκαν από άλλους. Παρομοίως, ο Philipp, η Annette, ο Jochen και ο Ernst οραματίζονται ότι τα ψηφιακά τους έμβρυα θα γίνουν αυτό που ονομάζουν «εικονικά έμβρυα»: πηγές όπου άλλοι επιστήμονες θα μπορούν να βλέπουν την αναπτυξιακή διαδικασία, να μεγεθύνουν για περισσότερες πληροφορίες και να προσθέτουν τα δικά τους σχόλια και αποτελέσματα. Στο απώτερο μέλλον, θα ήθελαν να επεκτείνουν το πεδίο του ψηφιακού εμβρύου και σε άλλα είδη, μιας και αυτό θα τους επιτρέψει να συγκρίνουν ποσοτικά την ανάπτυξη των διαφόρων εμβρύων, προσφέροντας πολύτιμη ώθηση στη μελέτη της εξέλιξης. Το ψηφιακό έμβρυο έχει πολλά περιθώρια ανάπτυξης, και καθώς πολλοί είναι αυτοί που είναι πρόθυμοι να βοηθήσουν, φαίνεται πως έχει μια πολλά υποσχόμενη ζωή μπροστά του.

Πηγή: http://www.scienceinschool.org/2010/issue15/zebrafish/greek